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上海宇劲生物孙经理 
·试剂盒规格、功能
Q1-1：一定要制备标准品吗？制备标准品时，是否必须使用MagCapture™外泌体提取试剂盒PS？
A1-1：定量检测时，需要制备作为标准品的细胞外泌体。超速离心法和聚合物沉淀法等提取的细胞外泌体也可作为标准品，但还是推荐使用与检测原理相同的PS亲和法提取的细胞外泡作为标准品。（详细制备方法请参考MagCapture™外泌体提取试剂盒PS的使用说明书）。
Q1-2：为什么没有配套的标准品？
A1-2：每种细胞分泌的细胞外泌体的表面标记蛋白的种类和含量存在差异，标准品和检测样品的来源细胞必须一致。因此本试剂盒未配套标准品，请制备与样品相同来源细胞的细胞培养上清中提取的标准品。
Q1-3：血清、血浆样品可直接检测吗？
A1-3：PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（Streptavidin HRP）可以直接检测。
但是PS Capture™ 外泌体 ELISA 试剂盒（抗小鼠IgGPOD）配套的检测二抗与人、小鼠、大鼠lgG发生非特异反应，不适用于人、小鼠、大鼠的血清和血浆样品的直接检测。
Q1-4：细胞培养上清样品可直接测定吗？
A1-4：无论哪个试盒都可以直接检测。由于PS Capture™外泌体ELISA试剂盒（抗小鼠IgGPOD）配套的一抗（抗CD63抗体）和二抗都不与牛lgG发生非特异性反应，可直接检测无血清培养基和含FBS培养基的细胞培养上清。另外，PS Capture™外泌体ELISA试剂盒（链霉亲和素HRP）配套的生物素标记抗体（抗CD63-生物素），链霉亲和素HRP也相同。
请用于细胞培养上清样品中的细胞外泌体的定量分析和定性分析。
Q1-5：可以变更一抗吗？
A1-5：可以。使用PS Capture™外泌体ELISA试剂盒（抗小鼠IgGPOD）时，先选择想检测的表面标记小鼠抗体，请根据使用说明书确定最佳浓度。
使用PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（链亲和素HRP）时，先选择任意的表面标记检测用生物素标记抗体，请根据使用说明书确定最佳浓度。无法获取生物素标记抗体时，可以使用Biotin Labeling Kit-SH（产品编号：348-90941）或Biotin Labeling Kit-NH2（产品编号：347-90891）非标记抗体进行生物素标记。
Q1-6：残留的试剂应该如何保存？
A1-6：请参考使用说明书的[6.试剂盒拆分使用时，各组成试剂的保存方法】。
Q1-7：哪些细胞是有纯化实例以及检测实例的细胞。
A1-7：下表为Wako已测试过的细胞系
细胞株 | 来源 | Isolation | ELISA |
| A549 | 人肺泡基底上皮腺癌 | — | O |
| BxPC-3 | 人胰腺癌 | — | O |
| COLO201 | 人结肠癌 | O | O |
| CoS7 | 非洲绿猴肾 | O | O |
| FM3A | 小鼠乳腺癌 | O | O |
| HCT116 | 人结肠癌 | O | O |
| HEK293 | 人胚胎肾 | O | O |
| HEK293T | 人胚胎肾 | O | O |
| Hela | 人宫颈癌 | O | O |
| HPAF II | 人胰腺肿瘤 | — | O |
| HuH-7 | 人肝癌 | O | O |
| HUVEC | 人脐静脉内皮细胞 | O | O |
| iPS | 诱导多能干细胞 | O | O |
| K562 | 人慢性粒细胞白血病 | O | O |
| LNCaP | 人前列腺癌 | O | O |
| P388D1 | 小鼠白血病 | O | O |
| Panc-1 | 人胰腺癌 | — | O |
| RAJI | 人伯基特淋巴瘤·B淋巴细胞样 | O | O |
| SH-SY5Y | 人神经母细细瘤 | — | O |
| TIG-3 | 正常的二倍体成纤维细胞 | O | O |
| THP-1 | 急性单核细胞白血病 | O | O |
| U2OS | 人骨肉瘤 | O | O |
| BM-MSC | 骨髓来源间充质干细胞 | O | O |
| iCell-MSC | iPS 来源间充质干细胞-01279 | O | O |
—：未测试 O：有纯化和检测数据
Q1-8：本试剂盒可以检测细胞外泌体的回收率吗？
A1-8：可以，请参考P25的与聚合物沉淀法比较回收率。
·与传统方法比较
Q2-1：检测灵敏度高吗？
A2-1：已证实该试剂盒检测细胞外泌体，相比使用固相化抗体的ELISA方法或将纯化样品直接固定在平板上的灵敏度要更高。此外，已经实验验证本试剂盒与Western blotting有相关性。
·试剂盒的操作方法、组成
Q3-1：本试剂盒的操作时间需要多久？
A3-1：PS Capture™ 外泌体ELISA 试剂盒（抗小鼠IgGPOD）的操作流程需要约5h。具体包括：①将细胞外泌体样品固定在孔板上需要2h；②一抗的反应需要1h；⑤二抗反应需要1h；④TMB反应需要30min。再加上其他清洗操作，大约需要5h才能完成检测。
PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（链亲和素HRP）的操作流程需要约6h。具体包括：①将细胞外泌体样品固定在孔板上需要2h；②一抗的反应需要1h；⑤链亲和素 HRP反应需要2h；④TMB反应需要30
min。再加上其他清洗操作，大约需要6h才能完成检测。
添加终止液后，检测450nm和副波长620nm（600~650nm）的吸光度。
Q3-2：Exosome Capture 96 Well Plate是可循环使用的吗？
A3-2：终止液会使孔板上的蛋白变性，因此不可循环利用。
Q3-3：实验操作中有可以留到第二天的步骤吗？
A3-3：将各样品固定在孔板上并保存于4℃，过夜反应也是没有问题的。
·样本用量
Q4-1：检测使用的样品的最低量是多少？
A4-1：有相当于1ng左右细胞外泌体的蛋白即可检测。从COLO201细胞培养上清中提取的细胞外泌体检测界限为11pg。（细胞系不同检测界限也随之变化。）
Q4-2：直接检测培养上清和体液样品时，需要多少样品？
A4-2：几微升（1~5uL）左右的细胞培养上清和体液样品即可充分检测。建议用于检测培养基中的细胞外泌体量随时间变化，以及分析新型培养上清样品。但由于细胞类型（iPS细胞等）不同，可能出现培养基中的细胞外泌体量少的情况。不清楚样品中的细胞外泌体量时，推荐进行预实验确定合适的上样量。
·相关产品
Q5-1：有推荐使用的一抗吗？
A5-1：以下抗体是Wako已验证可在该ELISA法中使用的抗体。
| 抗原 | 反应 | 抗体 | 品牌 | 应用 |
| CD9 | 人、牛 | 抗CD9小鼠单克隆抗体（1K） | Wako，产品编号： 018-27761，014-27763 | WB、ELISA、FCM、IP |
| CD63 | 人 | 抗CD63小鼠单克隆抗体（3-13） | Wako，产品编号： 016-27061，012-27063 | WB、ELISA、FCM、IP |
| CD81 | 人 | 抗CD81小鼠单克隆抗体（17B1） | Wako，产品编号： 015-27771，011-27773 | WB、ELISA、FCM、IP |
| CD9 | 小鼠 | 抗CD9大鼠单克隆抗体（MZ3） | Bio Legend，产品编号： 124802 | ELISA |
| CD63 | 小鼠 | 抗CD63大鼠单克隆抗体（NVG-2） | Bio Legend，产品编号： 143902 | ELISA |
| CD81 | 小鼠 | 抗CD81亚美尼亚仓鼠单克隆抗体（Eat-2） | Bio Legend，产品编号： 104902 | ELISA |
·疑难
Q6-1：无法顺利检测结果，应该如何处理？
A6-1：请确认使用的各个试剂是否都还在有效期内。请务必添加Exosome Binding Enhancer（100×）至Washing Buffer.若是无法确认试剂盒配套的Control Primary Antibody Anti CD63（100×）和Control Biotinylated Antibody Anti-CD63（100x）的信号的情况下，请考虑CD63的表达量是否在检测界限之下或其他原因，或咨询Wako在当地的代理商。
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