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上海宇劲生物孙经理 
货号：299-77603、293-77601
外泌体是活细胞分泌的30-150纳米的囊泡，里面包含了蛋白、DNA和RNA。近年来发现：外泌体不仅参与了细胞间通信，也影响肿瘤的生长和转移、肿瘤的微环境、免疫调节等。外泌体是在血液、唾液、尿液、脑脊液和母乳等多种体液中均有分布，以外泌体作为疾病诊断标志物开发的液体活检技术，正显示出巨大的临床应用前景。另外，外泌体天然赋予的精准靶-归巢特异性和跨越体内生物屏障的能力在药物递送方面也展示出很好的应用潜力，生物工程外泌体正在研发中。
Wako外泌体提取试剂盒采用磁珠和磷脂酰丝氨酸（PS）结合蛋白（PS亲和法）的方法进行纯化。该方去可简便获得高纯度的外泌体和其他来自细胞培养基和体液的小细胞膜泡。与传统的超离心法（纯度低），外泌体表面蛋白与抗体亲和法（无完整性），多聚物沉淀方法（杂质多）相比，可获得纯度高且具有完整性的外泌体。
| 品牌 | 货号 | 产品名称 | 规格 | 备注 |
| Wako | 299-77603 | MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS MagCapture™外泌体提取试剂盒PS | 2 tests | *每套试剂盒能完成5次回收实验，即实际使用量为2×5次/Kit与10×5次/Kit。 |
| 293-77601 | 10 tests |
产品说明书：
成功研发提取高纯度外泌体方法介绍：
新型亲和法外泌体提取试剂盒
MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS
原理：MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS采用磷酯酰丝氨酸（PS）亲和Tim4蛋白固化磁珠（PS亲和法）的方法，可以简便快捷地提取高纯度的完整外泌体和其他细胞外囊泡（EVs）。如果想要得到更高纯度的外泌体，请使用10，000×g离心后的上清。
该试剂盒使用含有EDTA的中性洗脱缓中液将外泌体完整洗脱下来，所提取的完整外泌体和其他EVs可用于不同实验，包括电镜分析（TEM）、纳米粒子追踪（NTA）分析、投喂实验、分子组成（蛋白质、脂质、核酸等）分析等。
·膜表面磷酯酰丝氨酸（PS）亲和法
Tim4蛋白固化磁珠，在金属离子存在的条件下亲和细胞外囊泡表面的磷酯酰丝氨酸（PS），然后使用含有EDTA的洗脱液进行洗脱，捕获高纯度的完整细胞外囊泡
·优点、特色
使用新型亲和提取方法
·通过PS亲和分子回收
·低背景值
·在中性条件下通过整合试剂进行温和洗脱
*可获得高纯度，完整的外泌体
无需进行超离
·使用磁珠改进了操作
·流程优化
*高重复性
| 与其他提取方法相比 | ||||
| 方法 | 外泌体纯度 | 状态 | 可操作性 | 回收量 |
| PS法 | ■■■ | 完整 | 简便稳定 | ■■■ |
| 超速离心法 | ■■ | 完整 | 简便 | ■■ |
| 聚合物沉淀法 | ■ | 完整 | 简便快捷 | ■■■■ |
| 密度梯度离心法 | ■■■■ | 完整 | 复杂 | ■■ |
| 抗体亲和法 | ■■■ | 不完整 | 简便稳定 | ■■ |
样品类型：细胞培养上清、血清、血浆、尿液等。
优点：
·可以纯化高纯度和完整的细胞外泌体
·可以从细胞上清液、血清、血浆和尿液中纯化外泌体
·重复性高，回收量稳定
·简易操作（约3.5小时）
·启用多个样品（无需超速离心）
·试剂盒组成
| 产品名称 | 包装规格 | 保存条件 | |
| MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS | 10次 （货号：：293-77601） | 2次 （货号：299-77603） | 2-10℃ |
试剂盒成分 （1）链亲和素磁珠 （2）生物素标记的外泌体捕获 （3）外泌体捕获免疫固定缓中液 （4）外泌体结合增强剂（×500） （5）洗涤缓中液 （6）外泌体洗脱缓缓冲液 （7）反应管 | <10次> 600μL×1管 100μL×1管 35mL×1瓶 500μL×1管 75mL×2瓶 5mL×1瓶 22管 | <2次> 120μL×1管 20μL×1管 7mL×1瓶 100μL×1管 30mL×2瓶 1mL×1瓶 1管 | |
*每套试剂盒能完成5次回收实验，即实际使用量为2×5次/Kit与10×5次/Kit。
·案例、应用
从血清、血浆、尿液中提取的细胞外泌体的分析
1、从人血清中提取外泌体的产量比较
使用该试剂盒，超离法和抗体亲和法提取人血清的外泌体，接着用CD9和CD63抗体进行免疫印迹实验。
·检测抗体
抗CD9兔多抗，System Bioscience公司
抗CD63兔多抗，System Bioscience公司
·免疫印迹（WB）数据
各样品结果相当于150uL的血清样本。从100L提取物中取出15L，添加5L的4×SDS样品缓中液，全部上样。
2、从人EDTA血浆中提取外泌体
分别从1mL的EDTA血浆、EDTA血浆（超滤更换缓中液）、人血清中提取外泌体，进行WB检测（抗Flotillin2抗体）。
·检测抗体
抗Flotillin-2小鼠单抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience公司
·使用样品量
各1mL
·免疫印迹（WB）数据
各样品结果分别对应150L样品量。从100uL提取物中取出15uL，添加5uL的4×SDS样品缓中液，全部上样。
3、从人尿液中提取外泌体的回收量比较
1mL人尿液分别通过本试剂盒、聚合物沉淀法、超离法进行外泌体回收，并做免疫印迹（WB）检测（抗CD9抗体）。
·检测抗体
抗CD9兔多抗，System Biosciences公司
·使用样品量
各1mL
·免疫印迹（WB）数据
各样品结果分别对应150L尿液样品。从100L提取物中取出15uL，加入5uL的4×SDS样品缓中液，全部上样。
·与传统沉淀法的功能比较实验
分别用本试剂盒、超商心法和聚合物沉淀法从K562（人慢性骨髓性白血病）细胞培养上清（无血清培养上清或10%Exosome-depleted FBS添加培养基）提取外泌体，分别比较三种方法的外泌体回收量和外泌体纯度。
MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS【PS亲和法】
按照试剂盒的操作说明（反应时间：3小时），从1mL经过离心处理（10，000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10%Exosome-depleted FBS添加培养基×1）中提取外泌体。
超速离心法
将10ml经过离心处理（10，000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10%Exosome-depleted FBS添加培养基*1）进行超离（110，000×g，70min），用TBS编中液重悬沉淀物后，再进行超离（110，000×g，70min），回收沉淀部分。
聚合物沉淀法
从1ml经过离心处理（10，000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10%Exosome-depleted FBS添加培养基1）中，按照市售的A公司产品的操作说明（静置时间：过夜）提取外泌体。
注释1，10，000×g离心2小时，在不吸到沉淀的前提下回收上清。
比较提取的外泌体的透射电子显微镜（TEM）分析结果和纳米检子追踪（NTA）分析结果
分别用本试剂盒、超离法、聚合物沉淀法提取外泌体，用NanoSight LM10检测外泌体片段的粒子直径。另外，用最终浓度为2%的多聚甲醛固定提取到的外泌体片段（2~4×1010 particles），在透射电子显微镜进行分析。
电子显微镜图像数据提供：金泽大学医学系华山教授、大阪大学iFReC 中井先生
MagCapture™可提取到很多100nm左右的粒子，在透射电子显微镜中也可以确认到很多细胞外囊泡。
K562细胞培养上清提取的外泌体回收量和纯度的比较（无血清培养基）
用PS亲和法、超离法和聚合物沉淀法从K562细胞培养上清（无血清培养基）获得样品进行电泳。接着用银染色和WB法（CD63，Flotilin-2和Lamp-1抗体）进行实验。
·检测抗体
抗CD63小鼠单抗（MEM-259）
抗Flotillin-2小鼠单抗（29/Flotillin-2），BD Bioscience公司
抗Lamp-1小鼠单抗（25/Lamp-1），BD Bioscience公司
K562细脆培养上清提取外泌体的回收量和纯度的比较（10%FBS-添加培养基）
用MagCapture™外泌体提取试剂盒、超离法和聚合物沉淀法，从K562细胞培养上清（10%去外泌体FBS补充培养基）获得样品进行电泳，用银染法和WB法（CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗体）进行实验。同时，对外泌体提取片段进行质谱测定，比较所有测定的多肽中来自K562细胞的人来源多肽的比例（由于添加到细胞培养基的FBS中牛蛋白聚集体是混杂的，所以人来源多肽的比率会下降）。
·检测抗体
抗CD63小鼠单抗（MEM-259）
抗Flotillin-2小鼠单抗（29/Flotillin-2），BD Bioscience公司
抗Lamp-1小鼠单抗（25/Lamp-1），BD Bioscience公司
健康人血清来源的外泌体中提取miRNA和mRNA的回收量比较
实验数据
①运用不同方法提取外泌体并比较从中提取的microRNA和mRNA的回收量
通过超离法和PS亲和法将EVs从正常人血清中分离，然后使用microRNA提取试剂盒（产品编号295-71701）提取RNA.通过qRT-PCR分析提取的RNA，并比较microRNA（let-7a，miR-16，miR-92a，miR-142-3p）、mRNA（GAPDH，PIK3CB）的Ct值。
相比超离法，PS亲和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高产量。
②运用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比较
运用PS亲和法将EVs从正常人血清中分离，然后使用microRNA提取试剂盒（产品编号295-71701）或基于AGPC法的试剂提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA，并比较microRNA（let-7a，miR-16，miR-92a，miR-142-3p）、mRNA（GAPDH，PIK3CB）的Ct值。
对比AGPC法，使用microRNA提取试剂盒更能有效提取PS亲和法纯化所得EVs中的microRNA和mRNA
·外泌体蛋白质组学分析
<实验内容及结果>
分别利用PS亲和法、超离法、聚合物沉淀法，从含10%FBS（不含外泌体）的K562细胞培养上清液中提取外泌体。将提取样品用10%聚丙烯酰胺电泳分离，剪切出全部的蛋白质条带。然后在疑胶内进行消化，用LC-MS对蛋白质进行检测。对上述三种方法提取的外泌体进行蛋白质组合的相关性比较。
比较通过MASS分析鉴定的前10个蛋白质
白色柱：源自外囊泡的人类蛋白质
灰色柱：来自FBS的牛蛋白污染物
红色：来自外囊泡的标记蛋白
样品：K562细胞培养基（含有10%去除外泌体胎牛血清）
| PS亲和法 | 超离法 | 聚合物沉淀法 | |
| 1 | 71kDa热休克同源蛋白 （Heat shock cognate 71kDa protein） | DNA依赖蛋白激酶催化亚基基因 （DNA-dependent protein kinase catalytic subuniy） | 补体C3 （Complement C3） |
| 2 | 膜联蛋白A6 （Annexin A6） | 铁转蛋白受体1 （Transferrin receptor protein 1） | a2-巨球蛋 （Alpha-2-macroglobulin |
| 3 | 铁转蛋白受体1 （Transferrin receptor protein 1） | 血清白蛋白 （Serum albumin） | 纤连蛋白 （Fibronectin） |
| 4 | V-ATP酶A亚基 （V-type proton ATpase catalytic subunit A） | ATP依赖RNA解旋酶 （ATp-dependentRNA serum abumin） | 血清白蛋白 （Serum albumin） |
| 5 | 浮舰蛋白-2 （Flotillin-2） | 微管蛋白β5 （Tubulin beta-5 chain | 血小板反应蛋白-1 （Thrombospondin-1） |
| 6 | 程序性细胞死亡6互作蛋白 （Programmed cell death 6-interacting protein） | 71kDa热休克同源蛋白 （Heat shock cognate 71kDa protein） | 补体C4 （complementc4） |
| 7 | 细胞表面抗原4F2重链 （4F2 cell-surface antigen heavy chain） | 脂肪酸合成酶 （Fatty acid synthase） | α-1抗蛋白酶 （Alpha-1-antiproteinase） |
| 8 | 膜联蛋白A1 (Annexin A1） | 细胞表面抗原4F2重链 （4F2 cell-surface antigen heavy chain） | 载脂蛋白-β-100 （Apolipoprotein-β-100） |
| 9 | 20kDa激酶D相互作用底物 （Kinase D-in teracting substrate of 20kDa） | U5小核核糖核蛋白的解旋酶 （U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase） | 胎儿血红蛋白亚单位 （Hemoglobin fetal subunit beta） |
| 10 | 膜联蛋白A2 （Annexin A2） | β4微管蛋白 （Tubulin beta-4 chain） | β5微管蛋白 （Tubulin beta-5 chain） |
成对组合相关性比较
·应用数据
Protein Assay BCA Kit检测外泌体的蛋白质浓度
Protein Assay BCA Kit是利用二辛可宁酸（BCA）定量检测溶液中的蛋白质浓度的试剂盒，是蛋白质定量检测法中最通用的方法。其原理为，碱性条件下的蛋白质Cu2+离子被还原为Cu+。Cu+与BCA形成络合物，即产生紫色螯合物，蛋白质浓度与紫色螯合物颜色深浅有关，通过测定562nm处的吸光度，并与标准曲线做比照，即可定量溶液中的蛋白质浓度。
利用MagCapture™外泌体提取试剂盒从细胞培养上清液中提取外泌体，通过Protein Assay BCA Kit高灵敏的检测外泌体中蛋白质浓度。
【实验内容及结果】
将通过MagCapture™外泌体提取试剂盒提取的25uL外泌体溶液分注于96孔板中，加入Protein Assay BCA Kit中试剂A和试剂B混合液200μL。之后60℃孵育30分钟，检测560nm吸光度（图1）。结果表明，通过Protein Assay BCA Kit的高灵敏度检测，可测定提取后外泌体中蛋白质浓度。
<BCA Assay 操作概要>
由于外泌体蛋白质浓度相当低，因此BCA测定时不要稀释样品。
①将BSA标准溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625ug/mL和空白对照，分别每孔25uL加到96孔板中。
②分别把提取的外泌体和洗脱缓冲液（空白）按照每孔25uL加入96孔板。
⑤把200uL Protein Assay BCA Kit（产品编号：297-73101）的试剂A盒试剂B混合液（A:B=50：1）加入放有样品的孔板中。
④60℃孵育30分钟
⑤室温条件下降低孔板温度
⑥测定560nm的吸光度
| 货号 | 产品名称 | 包装 |
| 297-73101 | Protein Assay BCA Kit 蛋白测定试剂盒（二喹啉甲酸） | 250次用 |
| 015-25613 | 2 mg/mL Albumin Solution from Bovine Serum 2mg/mL牛血清蛋白溶液 | 1mL×10 |
·外泌体的标记和Hela细胞导入实验
【实验概要】
用PKH67（Sigma公司）标记MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的细胞外囊泡，Hela细胞导入确认
<外泌体PKH67标记>
1.MagCapture™外泌体提取试剂盒提取外泌体（实验当天从K562细胞培养上清液提取外泌体）
2.用BCA Assay和NanoSight检测样品的蛋白质浓度和粒子浓度
3.将相当于5ug*蛋白量的外泌体样品溶液分装至1.5ml管中。
*请配制合适的使用量
4.将2.0uL的PKH linker溶解在0.25mL的DiluentC中。..4xDye solution*
*请配制合适的使用量
5.添加1/3样品量的4 x Dye solution至样品中，混合后在室温中育5-10分钟。
6.根据附带的操作说明用PBS平衡Exosome Spin Columns（MW 3000）（Thermo公司）。
7.将100L样品分别加入上述平衡后的旋转柱*中，离心（最大添加量：100uL）。
*准备必需的支数。
8.将外泌体溶液*入到已经接种好Hela细胞的培养皿中，24小时后用显微镜观察并利用流式细胞仪进行分析。
*根据实验调节外泌体添加量
图1.PKH标记外泌体的细胞捕获观察
从16mL K562培养上清液中超滤浓缩得到4mL培养上清液作为样品，通过PS亲和法提取外泌体。
·提取的外泌体蛋白质浓度：22.3ng/uL
·粒子浓度：1.2×108 particles/mL
将上述标记的外泌体溶液全部加入接种好的Hela细胞中，24小时后用荧光显微镜（左）和流式细胞仪（右）检测捕获情况。
Opti-MEM：取相同量用PKH标记后添加到细胞中作为阴性对照。
·细胞培养上清·血清·血浆的预处理操作
样品预处理：对样品进行1，200×g离心操作*1。如果要得到更高纯度的外泌体，则按照下述步骤对样品进行10，000×g离心操作*2。
下文是细胞培养上清、血清/血浆的预处理方法。其他体液样品的预处理操作，请参考血清/血浆的实验步骤，做适当调整。
更换缓冲液（限制过滤）操作
用50mLTBS缓中液对1mL已经经过离心处理的EDTA血浆样品进行缓冲液更换。
1.把19mLTBS加进VivaSpin20（100K）中。
2.把1mL 离心过的EDTA血浆上清添加在第1.的VivaSpin20（100K）中，混匀。
3.把第2.的VivaSpin20（100K）在4℃下进行离心处理。
4.减少上线的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加10mL TBS缓中液。
5.4℃下离心处理。
6.减少上面的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加10mL TBS缓中液。
7.4℃下离心处理。
8.减少上面的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加11mL TBS缓中液。
9.4℃下离心处理直至样品液量达到1mL以下。
10.进行提取。
·MagCapture™外泌体提取试剂盒操作步骤
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| 058-09261 | EV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent EV-Save™ 细胞外囊泡吸附抑制剂 | 1 ml |
| 052-09301 | Exosomes, from COLO201 cells, purified COLO201来源外泌体（已纯化） | 50 μL |
PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Streptavidin HRP) PS Capture™外泌体ELISA Kit （链霉亲和素HRP） | 96 tests | |
| 297-79201 | PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Anti Mouse IgG POD) PS Capture™外泌体ELISA试剂盒（抗小鼠IgG POD） | 96 tests |
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| 012-27063 | Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13) 抗CD63单抗（3-13） | 100 μl |
| 014-27763 | Anti CD9, Monoclonal Antibody (1K) 抗CD9单克隆抗体（1K） | 100 μl |
| 011-27773 | Anti CD81, Monoclonal Antibody (17B1) 抗CD81单克隆抗体（17B1） | 100 μl |
| 385-14451 | UniWells™ Adapter 96 UniWells™共培养板96孔板适配器 | 1 ea |
| 388-14441 | UniWells™ Filter 0.6μm UniWells™滤膜0.6 μm | 50 sheets |
| 381-14431 | UniWells™ Filter 0.03μm UniWells™滤膜0.03 μm | 50 sheets |
| 384-14421 | UniWells™ Horizontal Co-Culture Plate UniWells™水平共培养板 | 10 set |
相关资料：
参考文献：
[1] W. Nakai, et al, Sci Rep 6,33935(2016).A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles. PMID:27659060
[2] A. Kraft,W81 Award. Regulating Cancer-Associated Fibroblast Biology in Prostate Cancer (2017).
[3]S. Osawa et al, Biochem. Biophys. Res. Commun,232-238(2017). Fibronectin on extracellular vesicles from microvascular endothelial cells is involved in the vesicle uptake into oligodendrocyte precursor cells. PMID:28499870
[4] S. Nagashima et al,,J. Virol,91(22)e00822-17 (2017). Characterization of the Quasi-Enveloped H epatitis E Virus Particles Released by the Cellular Exosomal Pathway. PMID:28878075
[5] T. Yoshida et al, Curr. Protoc. Cell Biol,11:777:3.45.1-3.45.18(2017). High Purity Isolation and Sensitive Quantification of Extracellular Vesicles Using Affinity to TIM4. PMID:29227551
[6]S. Saito et al, Sci Rep 8,3997(2018). Glycome analysis of extracellular vesicles derived from human induced pluripotent stem cells using lectin microarray. PMID:29507392
[7]H. Kobayashi et al, Nagoya J Med Sci,80(2),141-153(2018). Effects of exosomes derived from the induced pluripotent stem cells on skin wound healing. PMID:29915432
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