·评价ULTRARIPA Kit B buffer单独提取脂篱蛋白的能力

（数据提供：东京大学大学院药学系研究科卫生化学教室）

   用PBS清洗COS-1细胞后，用SDS buffer、1%Triton X-100 buffer，ULTRARIPA  Kit A buffer以及ULTRARIPA Kit B buffer溶解，离心（14，000rpm，5min，4°C）。分离可溶性组分和不溶性组分。不溶性组分用等量的SDS-PAGE sample buffer变性溶解。通过SDS-PAGE/Western印迹评价脂筏标记物中Flotilin 1的可溶解量。在普通1%Triton X-100和RIPA缓中液中，大部分的Flotilin 1保留在不溶性膜组分中，然而在ULTRARIPA Kit B缓冲液中几乎全部溶解了

各缓冲液的成分：

·SDS buffer（2%SDS，1%Triton X-100，50 mM HEPES·Na（pH 7.2），150 mMNaCl）

·UItraRIPA kit A buffer（1%NP-40 Alternative，0.1%SDS，50 mMTris-HCI（pH8.0），150 mMNaCl，

0.5%Sodium Deoxycholate）

·UltraRIPA kit B buffer（成分保密）

·1%Triton X-100（1%Triton X-100，50 mM HEPES·Na（pH 7.2），150 mMNaCl）

·用ULTRARIPA Kit观察NGF刺激依存的Integrin的脂筏转换

（数据提供：国立精神·神经医疗研究中心神经研究所疾病研究第五部）使用的样本：小鼠来源原代培养DRG神经细胞（DIV13，~106 cells/35mm dish）

目标蛋白：Integrin β1，Flotillin 1

步骤：

1.在存在和不存在50ng/mL NGF的情况下培养神经细胞（各准备2个样品）

2.用PBS清洗COS-1细胞后，添加150 uL ULTRARIPA Kit A-buffer，并在冰上孵育

3.离心分离可溶性组分①和不溶性组分

4.准备的2个A-buffer不溶性组分的样品，其中一个管添加150uL 1×SDS sample buffer使其完全溶解②

5.添加150uL B-buffer至另一管A-buffer不溶性组分中，悬浮沉淀物

6.离心并分离B-buffer可溶性组分③和不溶性组分

7.添加150μL 1×SDS-PAGE sample buffer至B-buffer不溶性组分中，使其完全溶解④

结果：

   与NGF刺激中未看到Flutillin的波动相比，观察到了Integrinβ1通过NGF浓缩在RIPA不溶性部分中。

·使用ULTRARIPA Kit分析神经突触相关蛋白的可溶性和复合物

（本数据是在Funakoshi与学习院大学理学部高岛明彦教授，住冈晓夫助教共同研究下取得）

■直接添加B-buffer验证溶解效率

使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的P2膜组分*

*P2模组分的回收步骤

   从小脑组织切除海马体以及大脑皮质，添加匀浆编中液（10 mM HEPES（pH 7.4），0.32 M Sucrose，protease inhibitors）并用Dounce型匀浆器破碎。

   低速（×1000g）10分钟离心组织破碎液，去除沉淀的核组分（P1组分）。

   上清（S1）组分用中速（×13200g）20分钟进一步离心，去除上清（S2）组分，回收沉淀的膜（P2）。

使用缓冲液条件：

SDS：2%SDS，50 mM Tris-HCI（pH 8.0），150 mM NaCl

19%Triton：1%TritonX-100，50 mM Tris-HCI（pH 8.0），150 mM NaCl 

ULTRARIPA Kit A-buffer（RIPA）：1%NP-40，0.5%deoxycholate，0.1%SDS，50 mM Tris-HCI（pH 8.0），150 mM NaCl 

B-buffer：非公开

步骤：

1.添加各缓中液100mL至P2组分中，在冰上进行超声处理

2.高速（×100,000g）离心破碎液，沉淀不溶性组分，回收各可溶性组分

3.添置100uL 2% SDS缓冲液至各不溶性组分并使其溶解。

结果：

   在经过验证的所有神经突触相关蛋白中，ULTRARIPAQ Kit B-buffer的溶解效率t比1%Triton X-100和RIPA编中液（A-buffer）高。

■验证神经细胞膜来源RIPA不溶性组分的B-buffer溶解效率

使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的P2膜组分

步骤：

1.添加200µl A-buffer（RIPA）至P2膜组分，在冰上进行超声处理

2.高速（×100，000g）离心破碎液，除去可溶性组分，单独分离不溶性组分。

3.添加200mL 2% SDS，A-buffer或B-buffer至A-buffer不溶性组分，在冰上进行超声处理

4.离心（×100，000g）各溶液，并分离可溶性组分和不溶性组分

5.为了检测B-buffer不溶性组分中残留的蛋白，添加2%SDS至B-buffer组分中使其完全溶解

结果：

发现B-buffer能够溶解神经细胞膜的RIPA不溶性组分中包含的大多数蛋白。

此外，还可以高效提取NMDA型谷氨酸受体亚基的GluN1和GluN2B。

另一方面，尽管PSD 95的可溶性有所提高，但发现它仍残留在B-buffer的不溶性组分中。

·使用ULTRARIPA Kit分析神经突触蛋白复合物

使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的P2膜组分

目标：NMDA型谷氨酸受体NMDAR（GluN1/GluN2B）

     AMPA型谷氨酸受体AMPAR（GluA1/GluA2）

步骤：

1.添加ULTRARIPA Kit B-buffer至P2膜组分，在冰上进行超声处理；

2.高速离心（×100，000g）破碎液，获取可溶性组分；

3.添加1μg对照lgG或抗GluN2B抗体或GluA2/3抗体至100μL可溶性组分，并在4C下反应1小时后，添加20μL bed vol Protein A磁珠并反应1小时；

4.用PBST（0.05% Tween20 in PBS）清洗磁珠3次；

5.添加1×SDS-PAGE样本缓中液，在100℃加热条件下洗脱。

结果：

   使用ULTRARIPA Kit B-buffer，NMDAR，AMPAR都能通过免疫沉淀特异性的检测出复合物。

*SYN(Synaptophysin)